TP : Localisation d’une mutation par électrophorèse sur gel d’agarose

Objectifs :

F Réaliser une électrophorèse pour séparer les fragments d’ADN d’un phage Lambda muté et d’un phage Lambda non muté

(bactériophage qui peut infecter Escherichia coli), digérés par les enzymes EcoRI et HindIII.

F Exploiter les résultats en s’aidant d’un logiciel de traitement d’image Mesurim afin d’identifier la souche mutée.

F Localiser précisément la mutation dans le génome.

Capacités mobilisés : dextérité dans les gestes techniques, sens de l’observation, raisonnement logique !

Matériel :

Ø ADN d’un phage Lambda de souche A pur, mélangé à l’endonucléase EcoRI, à HindIII et à EcoRI + HindIII

Ø ADN d’un phage Lambda de souche B pur, mélangé à l’endonucléase EcoRI, à HindIII et à EcoRI + HindIII

Ø Gel d’agarose avec 8 puits préparé à l’avance

Ø Solution de tampon 8.3 : TBE

Ø Solution de bleu de dépôt qui permet d’alourdir l’ADN et de suivre l’avancée de la migration (déjà mélangé à l’ADN)

Ø Solution de bleu pour la révélation des bandes : azure A

Ø Eau distillée

Ø Béchers, gants, micropipette + cônes, boite en plastique, cuve à électrophorèse, générateur, fils

NB : compte tenu de la lenteur de la migration des fragments d’ADN dans le gel, le TP se déroulera en 3 temps :

1- Mise en route de l’électrophorèse (15’)

1) Déposer minutieusement 12 microlitres de chaque tube dans les puits en respectant l’ordre indiqué au tableau.

2) Verser le TBE dans la cuve jusqu’à recouvrir le gel de quelques mm.

3) Connecter les fils et allumer le générateur avec un voltage de 100 volts.

4) Vérifier le bon fonctionnement du dispositif : des microbulles doivent apparaître à la cathode et à l’anode.

2- Exploitation du résultat obtenu sur un gel préparé à l’avance (1h30)

1) Etablir la carte de restriction du phage Lambda non muté en utilisant le document 1.

2) En déduire la taille des fragments obtenus à l’issue de la digestion par EcoRI, HindIII et EcoRI + HindIII

3) Représenter sur le document 2 le profil de migration attendu sur le gel (positions relatives).

4) Comparer votre schéma au résultat expérimental (attention les petits fragments sont souvent invisibles sur le gel) et repérer le phage muté.

NB : pour faire cette comparaison, vous pouvez travailler sur la photo du gel obtenu qui se trouve dans le dossier SVT de la classe.

5) Identifier l’enzyme qui va vous permettre de localiser la mutation en justifiant votre choix.

6) Ouvrir l’image correspondant à la photo interprétée du gel obtenu dans Mesurim.

7) Repérer les fragments connus et les nouveaux fragments apparus à cause de la mutation.

8) Utiliser les fragments connus issus de l’ADN digéré par les deux enzymes pour construire la courbe étalon : Log (taille du fragment en pb) = f(distance en pixels) en utilisant la fonction tableau du logiciel.

9) Déterminer la longueur des nouveaux fragments.

NB : pour gagner du temps, vous pouvez mesurer le spectre d’absorption sur une droite passant par toutes les bandes en partant de la bordure du gel.

10) En déduire la position de la mutation sur la carte de restriction.

3- Révélation des fragments obtenus pendant la séance (15’)

1) Eteindre le générateur et le débrancher.

2) Retirer le couvercle et récupérer le gel pour le glisser délicatement dans la boite en plastique.

3) Rincer le gel à l’eau distillée.

4) Immerger le gel dans l’azure A pendant 5’.

5) Rincer à nouveau le gel à l’eau distillée voire avec de l’éthanol si la coloration est trop marquée.

6) Comparer ce gel à celui sur lequel vous avez travaillé.

Document 1 : les sites de coupure des endonucléases EcoRI et HindIII sur le génome du phage lambda

L’ADN du phage lambda est bicaténaire et constitué de 48502 paires de bases. Son ADN a été entièrement séquencé et l’on connaît les sites de coupures des deux enzymes de restriction EcoR1 et HindIII. Cela permet de disposer de marqueurs de longueurs connues. On peut également, grâce à l’électrophorèse, comprendre l’action des enzymes de restriction en comparant l’action de EcoR1, HindIII et de EcoR1+HindIII sur l’ADN de ce bactériophage.

Document 2 : profils de migration attendus à compléter (positions relatives des fragments)
ADN de phage lambda	Digéré par EcoRI	Digéré par HindIII	Digéré par EcoRI et HindIII